Acidificación biológica con levaduras productoras de ácido láctico frente a la vía tradicional con ácido tartárico

Artículo con tablas en PDF adjunto.

El cambio climático tiene consecuencias evidentes en la viticultura y enología. Actualmente en las uvas se vienen observando niveles de acidez más bajos y contenidos en azúcares más altos. Todo esto origina grados alcohólicos potenciales y pHs más altos, generando dificultades fermentativas para las levaduras y bacterias lácticas. El pH es un parámetro fundamental en el vino por su efecto en la estabilidad de la materia colorante, tartárica y microbiológica del producto final, además de las sensación de frescor en boca. Niveles bajos de pH contribuyen a evitar la proliferación de microorganismos indeseables que pueden alterar el mosto/vino o incluso producir compuestos tóxicos, como el caso de las aminas biógenas. Además de ello, niveles de pH bajos aumentan la fracción de anhídrido sulfuroso libre y molecular, mejorando su acción antioxidante, antibacteriana y antifúngica. 

El pH del vino afecta a la estabilidad del color en el caso de los vinos tintos. El color depende de la concentración de antocianos y de sus combinaciones con los taninos. A pH ácido, la forma mayoritaria de los antocianos es el catión flavilio, de color rojo. A medida que el pH aumenta, la forma flavilio se transforma en la base quinona de color violáceo y en la forma carbinol, incolora. 

La inestabilidad tartárica de los vinos está causada por la aparición de sales tartáricas (de potasio o calcio) insolubles en el vino. El ácido mayoritario, el ácido tartárico, se encuentra en equilibrio en distintas formas salificadas en los pH habituales del vino. En torno a pH 3.6 se favorece la formación de bitartrato potásico, insoluble. De la misma manera, a pH 3.5 se favorece la formación de la forma insoluble de tartrato cálcico. En cambio, un pH inferior favorece la presencia de la forma soluble del ácido tartárico. 

Por último, para concluir con la exposición de la importancia del pH en los mostos y vinos, este juega un papel importante en las sensaciones organolépticas. La relación entre pH y cata es compleja debido a que las sensaciones ácidas y de equilibrio dependen de muchos otros factores, como el alcohol y la carga polifenólica del vino. Es por ello que establecer un pH óptimo para los distintos tipos de vino es una tarea inútil que puede carecer de sentido práctico. Aun así, es evidente que un aumento del pH repercute de manera negativa en el equilibrio general del vino. En esta línea, la fermentación secuencial de Saccharomyces cerevisiae y Lachancea thermotolerans puede contribuir positivamente a las características sensoriales del vino, aumentando la concentración de ácido láctico y reduciendo un poco el nivel de alcohol. 

El trabajo se realizó en Bodega Bideona de Villabuena de Álava, (Denominación de Origen Calificada Rioja, subzona Rioja Alavesa). Tradicionalmente, cuando la bodega necesita aumentar la acidez de sus mostos o vinos, la adición de ácidos es el método habitual. Se puede realizar en distintos momentos de la elaboración y el ácido más utilizado es el ácido tartárico, aunque también se pueden emplear los ácidos cítrico, málico y láctico. La dosis máxima está limitada y puede tener otros inconvenientes como un desequilibrio en boca. Dependiendo del momento y cantidad de la corrección, se puede inducir una inestabilidad tartárica, aumentando el coste en los procesos de estabilización del vino. Pero la aplicación de ácidos orgánicos no es el único método de acidificación del que el enólogo/a dispone hoy en día. Entre otras alternativas, la acidificación biológica consiste en el empleo de levaduras seleccionadas capaces de producir ácidos en sus rutas metabólicas, sea como producto principal o como subproducto. 

Estas levaduras pueden ser de la especie Saccharomyces cerevisiae, capaz de producir una pequeña cantidad de ácidos (málico, láctico o succínico) o levaduras no-Saccharomyces, como Lachancea thermotolerans, capaz de trasformar los azúcares presentes en el mosto en ácido láctico, aumentando la acidez y bajando el pH de una forma eficiente y muy natural. L. thermotolerans produce en su metabolismo ácido láctico mediante la transformación del piruvato por la acción de deshidrogenasas. De esta forma, se consigue reducir ligeramente el grado alcohólico del vino al mismo tiempo que se aumenta la acidez, ya que el metabolismo del carbono para la producción de ácido láctico compite directamente con la producción de etanol. Además, L. thermotolerans es capaz de producir una mayor cantidad de glicerol, mejorando la sensación en boca aportando dulzor y sensaciones suaves. 

Esta levadura no-Saccharomyces no es capaz de finalizar la fermentación alcohólica por ella misma debido a su poca resistencia al etanol y a sus elevadas necesidades de oxígeno, por lo que es necesario la inoculación secuencial o co-inoculación de levaduras Saccharomyces cerevisiae para la obtención de vinos secos. La levadura L. thermotolerans es muy similar morfológicamente a S. cerevisiae, aunque algo más pequeña, ambas son elípticas y geman en cualquier parte de la membrana.

El principal objetivo de este trabajo es estudiar el comportamiento y las ventajas del empleo de técnicas de biocontrol mediante la adición de levaduras no-Saccharomyces como agentes de acidificación biológica en vinos. Para ello se utilizó una técnica conocida como inoculación secuencial de levaduras de las especies Saccharomyces cerevisiae y Lachancea thermotolerans comparado con la adición de ácido tartárico y la siembra de únicamente la especie Saccharomyces cerevisiae. Lo que permitirá a la bodega implementar sus itinerarios enológicos adaptados al cambio climático. Por último, se estudia también el coste de la acidificación biológica frente a la acidificación tradicional. 

Materiales y métodos
En la realización del ensayo con 4 vinificaciones en paralelo, todos los tanques se sembraron con la misma levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae. En dos de ellas se realizó una inoculación secuencial a distintos tiempos de la misma cepa Lachancea thermotolerans. La nomenclatura de los ensayos es la siguiente:
•    Control sin ningún tipo de acidificación (Testigo).
•    Acidificación tartárica (Tartárico).
•    2 vinificaciones sembradas con levaduras no-Saccharomyces de la especie Lachancea thermotolerans (Láctico 1 y Láctico 2) e inoculadas posteriormente con Saccharomyces cerevisiae en diferentes momentos para frenar la producción de ácido láctico. 

Bodega 
Bodega Bideona es un proyecto de Península Vinicultores. Bideona controla más de 300 parcelas de tamaño medio inferior a media hectárea con las que elabora vinos de zona, de pueblo y de parcela. Pertenece al territorio de Rioja Alavesa, subzona situada en la orilla norte del río Ebro y se extiende a lo largo de 300 Km2 al sur de Álava. Abarca más de catorce mil viñedos situados en pequeñas parcelas o terrazas a lo largo de algo más de trece mil hectáreas. El clima de esta zona es atlántico, y los viñedos se encuentran protegidos por la Sierra Cantabria. Los suelos de la zona son en su mayoría arcillo-calcáreos y pobres en materia orgánica. Todo esto proporciona vinos con cuerpo, siendo una zona idónea para la plantación de la variedad Tempranillo.

Material biológico
Levadura seca activa de la especie Saccharomyces cerevisiae (D.O.Ca. Priorat, Tarragona) en todos los tanques y en el agua de rehidratación se usó protector de levadura reforzador de la membrana celular para aumentar su resistencia al estrés fermentativo. Nutriente complejo (amonio + fuente de aminoácidos + tiamina) igual para todos. Para llevar a cabo la fermentación maloláctica (FML) todos los depósitos se inocularon tras dar por finalizada la fermentación alcohólica (FA) con bacterias lácticas seleccionadas de la especie Oenococcus Oeni. En paralelo, se inocularon dos depósitos con un cultivo puro de Lachancea thermotolerans y posteriormente se realizó inoculación secuencial junto con la cepa Saccharomyces cerevisiae. 

Analíticas realizadas sobre los vinos 
a.    pH, acidez total (AT), anhídrido sulfuroso libre (SO2L) y total (SO2T) mediante valoración potenciométrica con analizadores automáticos. 

b.    Nitrógeno fácilmente asimilable (FAN), ácido málico (MH2), ácido glucónico, ácido láctico, ácido acético, glucosa + fructosa (G+F) mediante análisis enzimáticos multiparamétricos. 

c.    Grado alcohólico (% v/v) mediante ebullómetro. 

d.    Análisis de implantación de levaduras mediante test genético por PCR y electroforesis en gel de agarosa. 

e.    Calcio (Ca) y Potasio (K) se analizaron mediante absorción atómica. 

f.    Índice de polifenoles totales (IPT), la Intensidad colorante (IC) y las absorbancias a 420 nm, 520 nm y 620 nm se midieron con espectrofotometría UV-Visible.

g.    Análisis sensorial descriptivo siguiendo la metodología ISO 11035 en sala de la UR y análisis factorial estadístico mediante análisis de componentes principales (ACP) y software XLSTAT 2024.

h.    Estabilidad tartárica mediante conductimetría y turbidimetría. Para los análisis de estabilidad tartárica esta se determina rápidamente, mediante la medición de la conductividad eléctrica en diferentes condiciones. 

I.    Mini contacto (MC) se determina con la precipitación del KHT expresado en µSiemens y %. Este valor nos da el índice de estabilidad del vino en cuestión y es capaz de estimar la precipitación de cristales en el futuro. Para los vinos tintos el método requiere que el vino permanezca a -4°C durante 3 horas tras la adición de “cremor tártaro” de granulometría muy fina (hidrogenotartrato muy puro) a una dosis de 2g/100ml. La prueba de mini-contacto dura 4 minutos y 30 segundos y tiende a sobreestimar la inestabilidad tartárica de los vinos tintos. 

II.    Índice de Supersaturación Estable (ISS) se basa en la temperatura de saturación. El punto de saturación proporciona automáticamente la temperatura de saturación de la muestra en °C. La determinación se produce en el intervalo de temperatura comprendido entre -4°C y +32°C; se obtienen dos curvas cuya comparación permite el estudio de la inestabilidad de un vino. El método se basa en la comparación de las dos curvas conductimétricas y su intersección, que corresponde a la temperatura de saturación del vino.

Vendimia y tipos de elaboraciones
La uva se vendimió el 4 de octubre de 2023 de la parcela Vista Alegre en Baños de Ebro (D.O.Ca. Rioja). La uva fue despalillada y estrujada y posteriormente se encubó en 4 depósitos de 500 Litros de capacidad cada uno. Una vez encubada la uva, se sacó el mosto y se mezcló de nuevo entre los 4 tanques para una mayor homogeneidad de la masa. Posteriormente se inocularon según el esquema posteriormente descrito: 

•    Depósito Testigo, donde se añadieron los siguientes productos enológicos: sulfuroso a una dosis de 5,3 mg/L, 28 g/hL de protector de levaduras en el agua de rehidratación, 28 g/hL de levadura seleccionada y 20 g/hL nutriente complejo al principio y 30 g/hL de levaduras inactivas después de 5 días. Después de la FA, se trasegó el vino y se inoculó con un bacteria láctica seleccionada para el desarrollo de la FML.

•    Depósito Tartárico, donde se añadieron los siguientes productos enológicos: sulfuroso a una dosis de 5,3 mg/L, 28 g/hL de protector de levaduras en el agua de rehidratación, 28 g/hL de levadura seleccionada y 20 g/hL nutriente complejo al principio y 30 g/hL de levaduras inactivas después de 5 días. En el encube se añadieron 1 g/L de ácido tartárico. Después de la FA, se trasegó el vino y se inoculó con un bacteria láctica seleccionada para el desarrollo de la FML.

•    Depósito Láctico 1, donde se añadieron los siguientes productos enológicos: sulfuroso a una dosis de 2,5 mg/L. 28 g/hL de levadura Lachancea thermotolerans, 20 g/hL de nutriente complejo, 30 g/hL de nutriente complejo 5 días después y 30 g/hL de levaduras inactivas al día siguiente. A las 48 horas iniciada la FA se añadieron 28 g/hL de levadura seleccionada Saccharomyces cerevisiae rehidratada con 28 g/hL de protector. Después de la FA, se trasegó el vino y se inoculó con un bacteria láctica seleccionada para el desarrollo de la FML.

•    Depósito Láctico 2, donde se añadieron los siguientes productos enológicos: sulfuroso a una dosis de 2,5 mg/L. 28 g/hL de levadura Lachancea thermotolerans, 20 g/hL de nutriente complejo, 30 g/hL de nutriente complejo 5 días después y 30 g/hL de levaduras inactivas al día siguiente. A las 96 horas iniciada la FA se añadieron 28 g/hL de levadura seleccionada rehidratada Saccharomyces cerevisiae con 28 g/hL de protector. Después de la FA, se trasegó el vino y se inoculó con un bacteria láctica seleccionada para el desarrollo de la FML.

A continuación, se muestra en la Tabla 1 las analíticas iniciales del mosto de partida:
Una vez se dio por finalizada la fermentación maloláctica, todos los vinos se trasegaron a diferentes depósitos para eliminar las lías gruesas y posteriormente fueron embotellados el día 17 de enero de 2024 tras la corrección de sulfuroso. 

Resultados obtenidos y discusión:
Cinética fermentativa y resultados analíticos
Se muestran las curvas de la cinética fermentativa en las gráficas de la figura 2 y los resultados analíticos después de la fermentación alcohólica (FA) y antes de la fermentación maloláctica (FML) en la Tabla 2. 

Entre las diferencias encontradas más significativas en los resultados de los análisis químicos después de la FA, encontramos los valores de los azúcares residuales de la muestra Láctico 2, con 0,44 g/L. Se observa también diferencias en los depósitos con inoculación secuencial, que tienen más láctico, producido por la levadura Lachancea, sobre todo Láctico 2. Los dos mismos tanques tienen además acidez volátil más elevada, con valores de 0,32 y 0,34 g/L expresados en ácido acético, quizás debido a la menor fracción de sulfuroso libre. Los pHs son sustancialmente más bajos para estas dos muestras, por debajo de 4, y la acidez total es más alta, superando a las de las otras dos muestras en más de 0,5 g/L expresado en ácido tartárico. 

Durante la FA se midió diariamente la densidad y temperatura. La temperatura se mantuvo durante el proceso entre los 21 y 25ºC y la evolución de las densidades de todas las vinificaciones se muestran en el Gráfico 1, como se puede observar, la FA transcurre de manera progresiva y por igual entre los días 5 y 23 de octubre de 2023. Apenas existen diferencias en las 4 vinificaciones observadas a nivel de cinética, sin embargo, si respecto a los tiempos totales. El vino Láctico 1 tomó 2 días más en total y el vino Láctico 2 ocupó 3 días más respecto a las 2 primeras vinificaciones.

Análisis de implantación de las levaduras inoculadas 
Durante la realización del estudio se llevó a cabo un análisis genético de implantación de las levaduras empleadas para asegurar la presencia y actividad de las levaduras Lachancea thermotolerans y Saccharomyces cerevisiae, obteniéndose los siguientes resultados, que se consideran como buenos.
•    Testigo: 70% de Saccharomyces cerevisiae, 20% de levadura tipo A y el 10% restante de levadura tipo B.
•    Tartárico: 80% de Saccharomyces cerevisiae, 20% de levadura tipo A.
•    Láctico 1: 1,40 x 106 UG/mL de levadura de la especie Lachancea thermotolerans.
•    Láctico 2: 1,20 x 106 UG/mL de levadura de la especie Lachancea thermotolerans.

Una vez que se dio por finalizada la FA en los 4 depósitos, el vino se sangró y se procedió a inocular la bacteria láctica comercial (Lalvin VP41) para realizar la FML. Los depósitos se colocaron en una sala con control de temperatura para el correcto desarrollo de esta segunda fermentación. 

Cinética de la FML
A continuación, se muestran los gráficos de las cinéticas de la FML de todos los depósitos (Gráfico 2):

Como se puede observar en el gráfico 2, las FMLs de los depósito Testigo, Tartárico y Láctico 2 tuvieron lugar en 14 días en total, mientras que en el depósito Láctico 1 tuvo lugar en 22 días, probablemente por tener una concentración de partida de ácido láctico mayor.

Análisis de estabilidad tartárica y proteica: 
En este estudio es muy interesante saber la estabilidad tartárica, proteica y de materia colorante de los vinos, ya que esto, entre otras cosas, puede influir en los costes de elaboración.

En la observación de los datos de la Tabla 3 destaca, que siendo estables los 4 vinos frente al valor ISS, las muestras con inoculación secuencial tienen valores más altos, tanto en mini-contacto como en ISS, sobre todo el vino Láctico 2. Los pHs son menores en las muestras inoculadas, aunque las diferencias no son muy grandes, estas diferencias muy probablemente se deban a la producción de ácido láctico producido por parte del metabolismo de las levaduras Lachancea Thermotolerans. 

Donde mayores diferencias se pueden observar es respecto a la estabilidad de la materia colorante, siendo mucho mayor en las muestras inoculadas secuencialmente y en la estabilidad proteica, que en este caso obtienen valores de menor estabilidad, sin una razón aparente. El Calcio y Potasio sorprendentemente son mayores en estas últimas muestras, de nuevo sin ninguna razón aparente que lo explique. Por último, en relación al Índice CPKHT, los valores son mayores y, por lo tanto, son vinos algo menos estables frente a la precipitación de tartrato de calcio. Esto ocurre en los vinos inoculados con la levadura no Saccharomyces, principalmente en la muestra Láctico 2, que llega incluso a la inestabilidad.

Resultados sensoriales: 
A continuación, se muestran los resultados del análisis sensorial que se obtuvieron en la cata. Se contó con 12 catadores formados y entrenados para la realización de este estudio en la sala de catas del Centro Científico Tecnológico (CCT) de la Universidad de la Rioja (UR), que reúne las condiciones óptimas y cumple con las normativas para el correcto desarrollo del análisis sensorial. Cada catador probó los vinos y rellenó la ficha de cata siguiendo la metodología de análisis sensorial tipo descriptivo. Posteriormente, los resultados se agruparon y se procedió a la elaboración de un análisis estadístico del tipo factorial mediante componentes principales (ACP). 

Se puede observar también como la muestra Testigo es proveniente de un vino equilibrado, amargo y graso en boca, mientras que la muestra Tartárico destaca por sus sensaciones dulces y químicas. En cuanto a la muestra Láctico 1, podemos destacar que es la más fresca, con carácter vegetal y la que más sequedad tánica produce en boca. La muestra Láctico 2 destaca por su astringencia y acidez.

En la fase retronasal la muestra Testigo destaca por su carácter afrutado, licoroso y reducido, así como por su larga persistencia. La muestra Láctico 1 destaca por su carácter aromático herbáceo, láctico y de madera, mientras que las muestras Láctico 2 y Tartárico no destacan por ningún carácter en especial, ya que no se asocian a ningún descriptor en particular en el plano factorial. 

Resultados económicos:
A continuación, se muestran datos orientativos de los costes económicos al respecto de las técnicas de acidificación y estabilización tartárica del vino, considerando los gastos generales respecto a las diferentes tecnologías aplicadas en bodega:

•    Corrección de la acidez con ácido tartárico: el coste varía año a año respecto al precio del producto. En la vendimia 2023 (5€/kg)…………………........…. 0,75 €/hL

•    Estabilización por frío, considerando el coste de la electricidad (kWh), agua empleada (m3), KHT usado (kg), Kieselghür (kg), pérdidas de vino (hL), costes de mantenimiento y mano de obra……………………...…… 4,12 €/hL 

•    Estabilización con poliaspartato de potasio…….………………… 4,60 €/hL

•    Estabilización por electrodiálisis mediante alquiler de una máquina por prestación externa…………………………4,39 €/hL

•    Inoculación secuencial de Lachancea thermotolerans y Saccharomyces mediante acidificación con biocontrol….... 3,30 €/hL

En general, los resultados obtenidos son coherentes con otros estudios similares. El pH de los vinos inoculadas con L. thermotolerans disminuye, aunque muy ligeramente, en relación a las muestras inoculadas únicamente con S. cerevisiae, como consecuencia del aumento de la acidez total. Los grados alcohólicos no han variado. Donde más diferencias se aprecian es en la presencia del ácido láctico, que se incrementa en más de 1 g/L en los vinos inoculados. Curiosamente estos vinos presentan también mayor acidez volátil, quizás debido a su menor presencia de sulfuroso libre.

Respecto a los tiempos para completar las fermentaciones (FA y FML), no hay diferencias en la primera, pero si en la segunda, donde una las muestras inoculadas secuencialmente (96 horas) conlleva 8 días más respecto a las otras tres variantes.

El análisis sensorial también muestra diferencias notables entre las 4 elaboraciones como se podía esperar de este estudio. A nivel olfativo, la muestra Láctico 1 presentó un perfil con aromas de hierbas aromáticos y perfil mineral, Láctico 2 fue el vino mejor valorado, con aromas de fruta fresca, fruta madura y balsámicos. La muestra Tartárico presentaba aromas químicos y la Testigo aromas fenolados. En boca, el vino más fresco fue Láctico 1 y el más ácido y astringente Láctico 2. Las muestras Testigo y Tartárico fueron las más amargas en boca. 

Con respecto a la estabilidad, los resultados pueden sugerir que el momento de inoculación de Saccharomyces cerevisiae para completar la fermentación alcohólica pueden influir en la estabilidad final del vino. Los resultados generales muestran una estabilidad consistente en casi todos los parámetros evaluados. Sin embargo, la muestra Láctico 2 presenta inestabilidad tartárica (ISS y índice CPKHT), siendo las más estables las muestras Tartárico y Láctico 1. Respecto a la estabilidad proteica no se encontraron diferencias significativas.

A nivel económico, la única muestra que resultó inestable fue Láctico 2, por lo que este vino tendría un coste previsible de estabilización de 7,42 €/hL, siendo el más elevado de todos, posteriormente tendríamos la muestra Láctico 1 con un coste de 3,3 €/hL. Los procesos más económicos serían el de la vinificación Testigo (1,15 €/hL) y el del vino Tartárico (1,9 €/hL).

Conclusiones 
1. El desarrollo de las cinéticas fermentativas se dio de manera similar en la elaboración de los 4 vinos. Al final de la fermentación alcohólica, todas las muestras tuvieron el mismo grado alcohólico, por lo tanto, no hubo diferencias entre las vinificaciones inoculadas con levadura Saccharomyces cerevisiae y las que se realizaron con inoculación secuencial de levaduras Lachancea thermotolerans y Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, si se constató formación de ácido láctico en aquellos depósitos inoculados con L. thermotolerans.

2. El pH y la acidez total de las muestras inoculadas con Lachancea thermotolerans es menor que el de la muestra acidificada con ácido tartárico y aún menor que el de la muestra no acidificada. Estos resultados son coherentes respecto a la técnica de acidificación mediante biocontrol, constatando la producción de ácido láctico por parte de L. thermotolerans. La cantidad de ácido láctico está directamente relacionada con el momento de inoculación de la levadura Saccharomyces. Es evidente también que esta técnica puede utilizarse de manera conjunta con la acidificación tradicional en caso de que el ácido necesario para ello superase las limitaciones legales. 

3. En cuanto a los resultados sensoriales, las muestras inoculadas secuencialmente destacan por su intensidad y brillo en la fase visual, por sus aromas a pastelería, perfil mineral, notas frutales, florales y de plantas aromáticas, con aromas balsámicos y de especias. En boca por su frescura, mayor acidez y carácter vegetal y en retronasal son más herbáceos y lácticos. 

4. Parece que el momento de inoculación de la segunda levadura Saccharomyces cerevisiae podría influir en la estabilidad tartárica. Se necesitan entonces más estudios para optimizar los protocolos y comprender mejor los efectos de largo plazo en la estabilidad del vino.

5. A modo de conclusión final, este estudio confirma la viabilidad de la acidificación biológica con la especie Lachancea thermotolerans como técnica efectiva para mejorar la acidez de los vinos, ofreciendo beneficios sensoriales respecto a la acidificación tradicional con ácido tartárico, aunque tiene un coste económico de casi el doble. 

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